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非天然氨基酸的应用现状和前景

作者:andy       发布时间:2021-11-12       

背景及概述

蛋白质仅仅用20种天然氨基酸执行了一系列显著功能,仅有的20种天然氨基酸携有的功能基团数量有限,无法满足化学、生物科学研究和应用中对蛋白质结构和功能的需求。目前,通过化学修饰、基因定点突变和计算机辅助蛋白质设计,虽然对蛋白质的结构改造赋予了天然蛋白质新的功能,但这些方法都依赖于20种天然氨基酸本身;其用于修饰改造的功能基团仅有巯基、羟基、羧基、氨基等几种有限基团,功能化方式十分有限。与此相反,可人为赋予多样性功能基团的非天然氨基酸(UnnaturalAminoAcids)在蛋白质修饰中表现突出,这些非天然氨基酸含有酮基、醛基、叠氮、炔基、烯基、酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸根等多样性功能基团,可进行多种修饰反应,如:点击化学、光化学、糖基化、荧光显色等反应。通过非天然氨基酸对蛋白质进行修饰给其结构和功能的理论研究与应用带来了新的契机。

非天然氨基酸的应用现状和前景

 

种类

 

一系列非天然氨基酸已经被用在细菌、酵母和哺乳动物细胞中进行蛋白质修饰,其精确性和效率非常高;它们大多都是20种天然氨基酸的衍生物,现今报道的UAA衍生物有苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、丙氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、丝氨酸衍生物、赖氨酸衍生物等。

 

修饰方法与过程

 

1. 化学合成法

固相肽合成方法和半合成方法相结合能合成出含非天然氨基酸的大片段蛋白质。例如,在化学连接中,一个C端含一硫脂的多肽将和一个N端含半胱氨酸的多肽反应,在经历一个酰基重排后,硫脂键形成一个肽键将这两个片段连接在一起。固相肽合成和连接技术已经用于修饰蛋白质骨架、红细胞生成素同系物、荧光探针、信号蛋白、离子通道、组蛋白等。然而这项技术的应用受所需要保护基团的化学性质、连接位点、蛋白质折叠等限制。

2. 体外生物合成法

体外生物合成方法已经合成了含UAA的蛋白质。在这个技术中,缩短了的tRNAs被酶法连接到化学氨酰化的核苷酸上,这些目的tRNA从连接的天然氨基酸上去耦掉,同时与非天然氨基酸结合;随后细胞翻译系统在相应的空白密码子或者编码密码子下,使用这些带有非天然氨基酸的氨酰化的tRNAs合成蛋白质,但含有非天然氨基酸的氨酰化tRNA加合物稳定性很差。

3. 显微注射法

在体内,通过显微注射技术对蛋白质进行位点特异性修饰来自于体外生物合成方法的拓展。如非洲爪蟾蜍卵母细胞被显微注射进2种RNA:一种是编码蛋白质的mRNA,其目标位点含有UAG终止密码子;一种是合成的氨酰化较tRNA(suppressortRNA),它能装载相应的UAA。在体内,通过UAG终止密码子对蛋白质进行位点特异性修饰,其中非天然氨基酸有酪氨酸同系物、a一基氨基酸等。但它继承了体外生物合成方法的缺点,即校正tRNA必须在体外化学氨酰化带上UAA,氨酰化的tRNA不能被重复利用,只能应用于能进行显微注射的细胞口。

4. 营养缺陷型法

50年以前,研究者发现许多天然氨基酸的同系物能抑制细菌的生长,分析发现在这些氨基酸同系物存在下合成的蛋白质,其天然氨基酸已被同系物替换,这是因为氨酰-tRNA合成酶(aminoaeyl-tRNAsynthetase,aaRS)不能明显地把天然氨基酸和其同系物严格区分开来,例如,正亮氨酸(norleucine)能被甲硫氨酰-tRNA合成酶识别,氟苯丙氨酸(p—fluorophenylalanine)能被苯丙氨酰一tRNA合成酶识别。同时用4(s)一氟脯氨酸,4-氟苯丙氨酸和6~氟色氨酸(3种非天然氨基酸对脂肪酶进行修饰,其脂肪酶的结构和活性均未被破坏。DNA聚合酶是一种高的动力学酶,用大肠杆菌营养缺陷型菌株对DNA聚合酶中32个脯氨酸替换成4(R)一氟脯氨酸(4(R)一fluoroproline,(4(R)一F)Pro),完成了(4(R)一F)Pro对DNA聚合酶的修饰,而DNA聚合酶在其保真度、活性和敏感方面均未发生变化。但运用营养缺陷性菌株来进行非天然氨基酸对蛋白质的修饰,没有位点特异性、细胞不能持续生长,且非天然氨基酸仅是天然氨基酸的同系物。

5. 翻译后修饰法

蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用,它使蛋白质的结构更为复杂,功能更为完善,调节更为精细,作用更为专一。常见的蛋白质翻译后修饰过程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。通过在麦芽糖结合蛋白、人类生长激素和分枝杆菌磺基转移酶蛋白中,引入一个含6个氨基酸的共有序列(LCTPSR),它能被甲酰甘氨酸生成酶识别并修饰,从而生成醛基基团,新生成的醛基基团能进一步引人生物物理探针和抗原表位标签到蛋白质中。用叠氮基酪氨酸(3-azidoty—rosine)对钙调蛋白进行修饰,再用三芳膦同系物对其进行选择性的生物酰化修饰,从而开创了一种新的蛋白质位点选择性翻译后修饰方法。

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应用现状和前景

1. 生物催化

1)提高酶催化活性

在生物技术领域,酶经过化学修饰后能够在有机溶剂中高效地发挥催化作用,并表现出新颖的催化性能。现在研究者也引入许多催化基团到蛋白质中,细菌磷酸三酯酶PTE)以非常快的转化效率催化农药对氧磷水解,其活性已接近进化限制。利用tRNA'cu/TyrRS对,用L一(7-羟基香豆素一4一基)乙基甘氨酸或L一(7一甲基香豆素一4一基)乙基甘氨酸(对PTE进行修饰,其PTE的催化效率提高了8~11倍,这为酶的分子改造提高其活性提供了一条新的思路。

2)增强酶热稳定性

特氟龙能使阻燃和防火氟化高分子材料表面固化,受此启发,纽约大学金·蒙克莱尔研究小组开创了一种能增强蛋白质界面的工艺过程。借助营养缺陷性菌株和在培养基中加入对氟苯丙氨酸,制备了对氟苯丙氨酸磷酸酯酶,性能测试显示,这种酶蛋白具有类似于特氟龙的耐热性能,在60℃的高温下仍可保持结构稳定,同时活性和功能没有丝毫减弱。在同样温度下,天然蛋白质分子中的氢键会断裂,导致结构改变并发生蛋白质变性。通过此氟化氨基酸对蛋白质的修饰,给蛋白质热稳定研究开辟了新的视野。

2. 蛋白质结构和功能探针

光诱导化学反应存在自然界中,它能调节许多细胞和生物功能,Wang等。用光反应非天然氨基酸对一(2一四唑)苯丙氨酸(p-(2一tetrazole)phenylalanine,(p-Tpa))对肌红蛋白进行修饰,这给用光来调节蛋白质功能提供了可能。对甲氧基苯丙氨酸([C]p—methoxypheny1alanine)对P450进行修饰,修饰后P450和其它原子结合,可以用来阐明P450在配体位点的构象改变,同时也可以解释哺乳动物P450的复杂动力学现象。

3. 药物蛋白

在医疗蛋白开发上,大量同源修饰蛋白的产生是理想的_5。如对许多抗原和抗原决定簇来说,一个强烈的免疫反应是需要的,利用校正tRNAcLyur/TyrRS对,用对乙酰苯丙氨酸(p-acety|一phenylalanine)对抗体抗原结合片段进行修饰,这给多聚物医疗蛋白的产生提供了可能。

4. 蛋白质交联反应

蛋白质交联在疫苗开发、药物传递、功能型水合胶方面发挥着重要作用。这些交联虽然发生在自然中,但实验室很难应用这个方法。通过3,4一二羟一L一苯丙氨酸(3,4-dihydroxy—L-phenylala—nine)对GFP蛋白进行修饰,从而实现了蛋白质与多聚糖的生物交联,这给蛋白质交联和合成生物学的发展带来了新的希望。用对炔丙基氧苯丙氨酸(p-propargyloxyphenyla1anine,(pPa))完成了二氢叶酸还原酶和超折叠绿色荧光蛋白的修饰,由于pPa含有酮基,它能在一价铜离子介导下使炔基与叠氮基发生交联反应,同时pPa对UV不敏感,这使异源蛋白质间的交联也成为了可能。


制备


一种制备非天然氨基酸及其手性拆分的方法,本法以金刚烷甲酸为原料,制备3-羟基金刚烷甲酸,再经过氯化、氧化等得到2-(3-羟基-1-金刚烷基)乙醛酸,与盐酸羟胺反应得到3-羟基金刚烷乙醛酸肟,用还原剂还原并用Boc酸酐保护得到N-叔丁氧羰基-3-羟基金刚烷基甘氨酸。再用有机碱拆分得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基金刚烷基甘氨酸和(R)-N-叔丁氧羰基-3-羟基金刚烷基甘氨酸两种非天然氨基酸。本发明与已有技术相比,改进了合成工艺,反应条件温和,环境污染小,适合工业化生产。

 

写到最后

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