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多肽合成切割的8个小知识

作者:andy       发布时间:2024-05-21       

之前固拓小编发过一次固拓生物的#多肽切割操作流程,现在又整理了一波小知识,希望能够帮助到大家。多肽切割在固相合成中有着很关键的作用,如果切割的干净,不仅能提高收率也给纯化工作带来便捷。刚刚接触多肽合成的小伙伴们,通常都会在切割液的选择有许多的疑问,那么让我们聊聊多肽切割的一些小知识。

切割(Cleavage)属于肽合成的后处理部分,是指将已合成的肽从载体(树脂)上切割下来。有人认为也包括脱去侧链保护。切割及去保护是合成中最重要步骤。如果试剂和反应条件选择不当,产物会发生不可逆的修饰而被破坏,因此在切割时应注意以下几个问题:

1、选择合适的试剂浓度、反应时间、温度等条件;

2、根据合成肽氨基酸的不同而选择合适的切割及脱保护试剂;

3、氨基酸侧链的保护,在切割时,切割试剂或切割产物可能对一些对其敏感氨基酸侧链造成破坏或修饰,因此,反应时要选择合适试剂和条件,必要时,对敏感侧链进行保护,使其遭到最小程度的破坏。

一、什么是“切割”?

固相合成结束后,如果想从树脂上切下多肽,需要选择合适的切割试剂,然后用冰乙醚沉淀,离心采集沉淀物,通过HPLC分离纯化,冷冻干燥获得产品。(下列切割均针对树脂进行处理)

二、是前后切割过程。

三、切割流程

准备要切割的树脂

这里只需要树脂里面的溶剂成分被洗涤掉并充分干燥树脂,理想状态是:像干燥的沙子一样,不容易占到其它物体的表面,例如瓶子或者纸。

四、切割液的选择与配置

这方面资料在网上也有很多,针对不同的多肽序列,选择不同的切割液种类。

这里主要列几种常见的切割液比例。

1)TFA:H2O=95%:5%、TFA:H2O=97.5%:2.5%

2)TFA:H2O:TIS=95%:2.5%:2.5%

3)三氟乙酸:茴香硫醚:1,2-乙二硫醇:苯酚:水=87.5:5:2.5:2.5:2.5

前两种适合没有容易氧化的氨基酸,例如Trp、Cys、Met。第三种都可以使用。(每1g树脂加8ml左右的切割液)

五、切割过程

一般时间在2.5小时左右,要不断地震动,温度为室温。

有些多肽很容易氧化或变质,还需要排除容器内的空气(用氮气代替),有时还需要适当降低环境温度,比如0-10℃。

六、抽滤器收集滤液

抽滤的方法很多,每个实验室都有自己的方法,小编主要说下,这是的滤液里面含有被切割下来的多肽和一部分侧链保护基团。一些不溶于TFA的保护基团,例如Pbf,是一种白色漂浮物,同树脂一起被过滤掉了。

七、沉淀,离心,洗涤

小编认为 这个步骤是最影响收率的一步,处理不好的话,就会损失很多 多肽。

1)溶剂:沉淀用的是冰乙醚,这里的冰字是要求 乙醚的温度要很低,例如放置在-20摄氏度的冰箱里面。当然使用常温的乙醚,也是可以的。乙醚和滤液的体积比为6:1比较合适。

2)仪器:能达到3000转每分钟的离心机

3)方法:在时间允许的情况下,小编建议 把滤液往6倍体积的冰乙醚慢慢地滴加,可以用磁力搅拌器搅拌冰乙醚。目标是让刚加进去的滤液立刻析出多肽。

4)离心:把已经析出,变白的溶液离心即可。

5)洗涤:一般建议洗涤3次,每一次都要把溶液搅拌均匀。

八、抽干,得到粗品肽

离心3次之后的肽,各种侧链保护基团基本被乙醚洗涤了,这时只要将湿的多肽放到 真空釜 抽干即可。(别放恒温箱里面)

我相信如果你按照上面的步骤一步一步来,你一定会得到理想的回报。因为很多多肽都有自己的特殊性,如果遇到一些特殊情况,可以随时联系小编。


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