细胞穿膜肽的介绍

细胞穿膜肽（CPPs）是由5-30个氨基酸组成的短肽，通过非经典胞吞机制携带蛋白质、核酸、脂质体等大分子物质进入细胞。其核心结构特征为富含精氨酸/赖氨酸的正电荷序列，通过静电作用与细胞膜相互作用，形成孔隙或直接穿透膜结构。研究发现，不同的氨基酸组成与二级结构（如螺旋结构、无规卷曲）显著影响穿膜活性，高活性肽段在三维空间中呈现特定聚类特征。

在药物递送领域，CPPs已成功应用于抗体跨膜运输、siRNA递送、纳米颗粒修饰等方向。例如TAT肽与抗体融合可突破传统胞吞限制，实现靶向肿瘤细胞的精准治疗，而R8修饰脂质体可提升核酸递送效率。

细胞穿膜肽的分类

到目前为止,已发现了多种CPPs,主要包括转录反式激活蛋白 (Tat)、VP22、transportan、模型两亲性肽 (MAP)、信号转导肽和富含精氨酸序列肽。

大多数已知的CPPs不具备明显的组织特异性 或细胞类型特异性,而是依赖于生理pH环境下氨基酸 (主要是富含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸残基) 的正电荷序列和细胞表面带负电荷的糖蛋白之间的静电相互作用而发挥作用。在生理pH条件下精氨酸的胍头基可以和细胞表面膜上带负电的磷酸基和硫酸基产生氢键结合,进而产生细胞内化作用。赖氨酸与精氨酸含有相同的净正电荷,但不含有胍头基,当其单独作用时穿过质膜的效果会差些。

根据细胞穿膜肽在序列、疏水性和极性等方面的特征,CPPs大致可以分为3类。

1.阳离子型肽

此类肽富含精氨酸,具有高度净正电荷且几乎不含酸性氨基酸残基,主要包括R9、Tat、hLF^{和 (RXR)}₄等。研究表明阳离子CPPs需要包含至少8个正电荷才能有效地被细胞摄取。阳离子CPPs在进入细胞时一般不会引起细胞应答反应,却会影响细胞膜的完整性和活性。

其中两种阳离子型肽值得一提,第一种是核定位信号序列肽 (nuclear localization sequences,NLSs),NLSs是一种较为特殊的阳离子型细胞穿膜短肽,富含赖氨酸 (K)、精氨酸 (R) 或脯氨酸 (P) 残基,可以穿过核孔复合体转运进入细胞核。NLSs一般又可以分为两种: ① 单分型NLSs (monopartite NLSs): 最初发现于猿猴病毒40 (SV40) 大T抗原中,它是 一段4～8个氨基酸组成的富含碱性氨基酸的短肽 (PKKKRKV),其核心序列可表示为K(K/R)X(K/R); ② 双分型NLSs (bipartite NLSs): 这类核定位信号以核质蛋白的核定位序列 (KRPAATKKAGQAKKKK) 为典型,它是由两簇碱性氨基酸残基组成,两簇碱性序列之间被10～12个非保守氨基酸残基间隔,其序列通式可以表示为R/K(X)10-12RRKK。由于大多数NLSs的电荷数量恰好小于8,所以NLSs不是有效的CPPs,但常被用来与疏水性肽序列共价连接以获得可以被有效摄取的两亲性CPPs。

还有一种是抗菌肽 (antimicrobial peptides,AMPs),抗菌肽是生物体防御外界病原体侵袭时产生的由基因编码、核糖体合成 的一类小分子活性多肽,是生物体内先天性防御系统的重要组成成分。抗菌肽在进入细胞的过程中会损伤细菌的细胞膜,具有杀菌剂的性质。在体外,几分钟内就可杀伤革兰阳性菌、革兰阴性菌、寄生虫、病毒及肿瘤细胞。常见的抗菌肽有LL-37、S413-PV和Buforin 2等。

2.两亲性肽类

由亲水结构域和疏水结构域构成,其所带正电荷主要依赖于赖氨酸残基,而两亲性的特征是由其一级结构和二级结构决定的。

一级结构的两亲性CPPs一般分为两种: 一种是疏水结构域与NLSs共价连接,包括MPG、penetrati和CADY等。以MPG为例,MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV) 的亲水区是SV40 NLS PKKRKV,而疏水区则是源自HIV糖 蛋白41的融合序列,两个区域通过WSQP连接键连接; 另一种则是全部由天然蛋白质分离获得,如血管内皮-钙黏蛋白 (pVEC)、ARF (1-22)和BPrPr (1-28)。

二级结构的两亲性CPPs具有α-螺旋的空间构 象,其亲水性氨基酸残基 (亲水端可以为阳离子、阴离子或极性基团) 和疏水性氨基酸残基分别位于螺旋结构的不同表面。富含脯氨酸序列或多聚脯氨酸序列的肽是此类肽的代表,它们都含脯氨酸-吡咯烷基团,在水中能形成螺旋状结构,如包含50% 脯氨酸残基、来源于玉米储藏蛋白的芳香箭头肽 (sweet arrow peptide,SAP),其序列为VRLPPP。

3.疏水性肽

此类CPPs仅含非极性残基,目前仅发现少量的疏水性CPPs,比如从整合素β3中发现的信号序列VTVLALGALAGVGVG以及卡波济成纤维细胞生长因子 (AAVALLPAVLLALLAP)。

一方面,不同类型的CPPs具有不同的穿膜行为; 另一方面,与CPPs相连的药物或载体的大小及理化性质、肽的长度和浓度以及细胞类型等因素都显著影响其穿膜效应。

细胞穿膜肽与药物或载体的连接方式

CPPs能够输送种类繁多的物质进入细胞,被转运物质的理化性质也不尽相同。因此,需要不同的连接方法将CPPs与被转运物质连接。其中,连接方式对CPPs在摄取水平和方式上有重要影响。

1.共价连接

共价连接是最常见的方法。通过稳定或可裂解的化学键 (如巯基-马来酰亚胺、酰胺键、二硫键和硫酯键) 将CPPs与被运送物质结合。在许多情况下,尽可能地选择可裂解的化学键来保证被运送物质的释放而发挥其生物功能。例如,二硫键是一种可逆性化学键,在胞浆大量还原剂谷胱甘肽或还原酶的存在下,二硫键可以发生断裂将被载药物释放。然而,从化学观点来看,CPPs共价连接技术在方法学上对被连接物有严格的限制,并且可能改变被连接物的生物活性,尤其是带电荷的寡核苷酸或siRNA。

2.非共价连接

基于该方法与载体结合的大多数是两亲性CPPs,如MPG肽、Pep-1肽与核酸、蛋白等,还有阳离子型的Tat和寡聚精氨酸。非共价结合相对比较简单,包括静电作用和疏水作用。运用非共价结合方法可以实现核酸和蛋白质等生物活性大分子的胞内递送并保留其生物活性。由于CPPs与核酸类药物进行化学连接存在困难,因此CPPs介导的基因递送系统通常采用基于静电作用的非共价连接方式。但需要注意的 是,与大分子量的阳离子聚合物相比,CPPs的分子质量较小,其结合并压缩核酸类药物的能力相对较弱,所形成络合物的结构通常不够紧密而不利于基因转导。因此,将CPPs与大分子阳离子聚合物共价连接后,再通过静电作用的非共价连接方式与核酸类药物形成络合物,能够获得较好的基因递送效率。

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