肽与蛋白质位点特异性修饰的研究进展

蛋白质与多肽是生命活动的核心功能媒介，体内天然的翻译后修饰能够精准调控蛋白的活力、定位与稳定性。人力完成肽和蛋白质的位点非特异性修饰，即在预设的单独氨基酸位点引进荧光基团、药物分子、糖链或同位素标记，是化学生物学、蛋白药物研发领域的关键技术。

综述《Recent Advances in Site-Specific Modifications of Peptides and Proteins》系统梳理了该角度的最新研究成果，将现有技术划分成四大类：基于氨基酸微环境差距的化学修饰、标识介导修饰、相邻驱动装饰与酶促修饰，分析各种技术原理、优点局限与生物医学运用，为该领域后续发展提供了清楚的架构。传统蛋白修饰方式大多借助氨基酸侧链的固有化学反应活性，比如赖氨酸氨基、半胱氨酸巯基的亲核反应，但蛋白序列中一般存在多个同类残基，反映欠缺位点区别能力，产物是多种装饰异构体的混合物，无法满足基础研究与生物医药的精准要求。位点特异性修饰技术的核心目标，便是打破“同一种氨基酸同样反应活性”的限制，在不破坏蛋白总体折叠结构的前提下，只在目标位点完成共价偶联。

基于蛋白部分化学环境差别的修饰对策，运用蛋白折叠带来的微环境差别，区别蛋白上化学性质相同但空间环境不同的氨基酸残基。蛋白折叠后，部分赖氨酸残基埋藏在疏水核心，部分暴露在溶剂；曝露残基四周的电荷、氢键微环境，会改变氨基的pKa值，从而实现单一位点选择性反映。该策略最大优势是无需对蛋白开展基因改造，直接向天然蛋白开展后期修饰，操作方便。但此方法普适性受限，选择性高度依赖蛋白本身三维结构，当目标位点所在微环境与其它残基差别较小时，很难获得高纯产物。标签介导装饰（tag-and-modify）是当前应用最广泛的对策之一。

此方法根据基因工程，在蛋白目标位置插进短肽标识或者非天然氨基酸，标签能够特异性识别对应的化学探针，发生高效、正交的生物偶联反应。常见体系包含四半胱氨酸标识与双砷染剂、非天然氨基酸介导的点击化学变化。该技术位点精确、选择性极高，不受蛋白三维结构影响，广泛用于活细胞内蛋白荧光标记、蛋白探头搭建。缺点是必须对蛋白开展基因编辑，引进额外氨基酸序列，可能影响目标蛋白天然折叠与生物学功能，在离体天然蛋白、临床蛋白药物改造场景下存有局限。相邻驱动化学修饰，借助分子间亲和功效，将反映探针聚集在目标氨基酸周边，借助部分高浓度完成位点选择性标识。典型代表是亲和引导催化体系：小分子配体结合蛋白特选择点后，携带催化基团在结合位点部分活化，仅对相邻氨基酸发生装饰。该策略不需要插进长肽标签，仅依靠配体-蛋白相互作用，即可实现天然蛋白的位点标识，适宜靶向酶、受体蛋白的原点装饰。但此方法依靠高亲和力配体设计，针对欠缺非特异小分子配体的蛋白，难以全面推广，同时容易出现非特异性背景标识。酶促修饰对策运用生物酶天然底物鉴别非特异，催化目标位点发生共价修饰。比如转谷氨酰胺酶、Sortase酶、卤化酶等，可以识别特定短肽序列，精确催化糖基、脂类、莹光基团或是药物分子连接到多肽、蛋白上。酶促反应标准柔和，在溶液、生理温度下即可进行，生物相容性好，副反应少，在抗体药物偶联物（ADC）的制备行业极具潜力。

酶促装饰的短板在于酶自身的底物序列限定，多数酶仅鉴别特定短肽基序，必须在蛋白序列保存鉴别位点；部分商用酶费用较高，大批量生产难度较大。肽与蛋白质位点非特异装饰打通从蛋白化学改造到生命体制分析、生物药物研制的关键通道。